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您的液相色谱还会老出问题吗?

     发布日期:2019-08-15 13:16    |   作者:admin 点击:
高效液相色谱仪(HPLC)是剖析实验室常用的测试仪器之一,其应用越来越普遍。此种仪器在运用过程中,难免会呈现各种各样的问题,并将直接影响到所测数据的精确性和仪器的正常工作。操作者假如能理解毛病的成因,即可分明预防和扫除这些毛病的发作,就可正确地运用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在运用高效液相色谱仪中需留意的几个问题。
一、运用试管的问题
1、试管的干净问题
高效液相色谱剖析法是一个很灵活的剖析办法,假如因运用不干净的试管,便会影响实验结果的精确性。例如,在用甲醇作溶剂来溶解样品时,所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的,因而,在每次进样时,都有一个保存时间固定的干扰峰存在,后经证明,此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生,换用玻璃试管后,干扰峰消弭。
2、塑料试管的溶解问题
近年来,一次性塑料试管给实验人员带来了极大的便当,但是,在运用过程中一定要留意有机溶剂对试管的溶解现象,在应用此种试管提取样品时,有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象,这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号,从而干扰样品的测定。这时,可用相同的实验条件先行实验一下,看看不含被抽提物时,提取液在检测器上能否产生干扰信号,如确有干扰信号存在,就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。
3、被测样品在试管壁上的吸附问题
这个问题也应惹起留意,否则也会影响测试结果的精确性,在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中,有些被测药物如阿米替林,丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上,因而,操作中宜采用聚丙烯管,为避免提取中吸附现象的发作,可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂,可有效地避免吸附。
二、操作进样阀的问题
目前,在剖析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀,其内部的六通阀构造使进样操作十分便当,但是,假如运用不当,也会带来问题。例如,在高效液相色谱法的实验过程中,有时会有异常色谱峰的呈现以及重现性不好的问题,这主要是由于操作办法不当所惹起,要想处理此类问题,需从以下几个方面动手。
1、进样量的控制
用进样阀来进样时,阀内的样品环是定量的,(普通剖析型进样阀的样品环体积为20ul),由于进样时,注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因而,要想使样品环中充溢样品溶液,从而运用进样阀来精确地定量,则必需使进样量大于样品环体积的2倍。假如用注射器来控制进样量,则最大只能注射样品环体积1/2的量,这样才干避免局部样品由溢流管溢出从而招致定量剖析的误差。
2、进样阀的清洁问题
假如样品环中有上次进样时样品的残留,必然会污染下次注射进的样品,为避免这种现象的发作,应按下列步骤操作:a.进样阀有2个位置,INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时,以注射器将活动相注入进样阀内清洗几次,每次用量大约40ul;b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时,再以活动相清洗几次,每次用量还是40ul;c.最后,再将样品注射到进样阀里。
依照上述的步骤操作,能够防止由进样阀惹起的污染,从而使干扰峰消弭并进步剖析结果的精确性。
3、进样阀溢流管的梗塞
有时,进样阀的溢流管会发作梗塞现象,向进样阀内注射样品时,注射针推不动。此毛病是由于溢流管的梗塞所致。梗塞的缘由多半是由于溶解样品的活动相用的是盐溶液,而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时,可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡,端口处盐的结晶就能被溶解掉,毛病扫除。如能在每次进样完成之后,用蒸馏水重复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出,则可防止此毛病的发作。
三、活动相(MOBLLE PHASE)的问题
甲醇和乙腈在高效液相色谱剖析法中常常被用来配制活动相。高效液相色谱法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂,如色谱纯试剂。在请求不太严厉时,优级纯以至剖析纯的试剂也能用。高效液相色谱剖析法中常用的是紫外检测器,因而,从降低基线噪音和进步剖析灵活度上来思索,应该运用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。
1、活动相的过滤
配制好的活动相在运用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是由于溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒,假如不把它们滤除掉,就会梗塞泵口、柱头上的过滤器,这样就梗塞了活动相的正常通道,使色谱柱的阻力增加,柱压升高,柱效降落。碰到这种状况时,要换用经过滤的活动相,并将梗塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟,以除去滤片上的梗塞物。
2、活动相的脱气
活动相在运用前必需脱气,以尽可能的除去溶解在活动相中的气体,否则,这些气领会使柱填料的性能降低,还可以对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种办法,如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目前最常用的脱气法。水和甲醇混合后会产生大量的气泡,假如不脱气就运用,气泡就会进入色谱柱和检测器,并将影响剖析工作的正常停止。
四、色谱柱的运用和颐养
色谱柱是高效液相色谱仪最主要的部件,被测物质能否被很好的别离和测定,色谱柱的性能起着决议性的作用。因而,在日常工作中,应特别留意色谱柱的正确运用和维修颐养,以延长色谱柱的运用寿命。
1、运用预柱和维护柱
预柱(pre-column)装置于泵和进样器之间,它给色谱柱中的活动相提供了完整的均衡,并避免了对柱填料有毁坏作用的组分或污染物进入色谱柱。维护柱(guard column)能够阻挠可以结实地吸附于色谱柱上的组分进入色谱柱,维护柱应与色谱柱的填料相同。预柱和维护柱能够经常改换,而不需求经常改换色谱柱,这就延长了色谱柱的运用寿命。
2、避免气体进入色谱柱
有些色谱柱(如凝胶柱)是不允许气泡进入的,否则将会使柱效降低以至构成微小的难以驱除的气室。因而,为了避免气泡进入色谱柱,一定要运用经过脱气的活动相,并且要严厉依照下列步骤来装置色谱柱:
a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝,察看能否有溶剂渗出;
b.如有溶剂渗出,即可将色谱柱接到管路上,以防止气泡的进入;
c.如无溶剂渗出时,标明色谱柱的此端曾经进去空气了,此时,可将色谱柱的出口端接到进样阀上,以活动相来反方向冲洗色谱柱,以便将柱内的空气扫除。最好以0.2ml/min的小流量来冲色谱柱,假如溶剂的流速太快或者是压力忽然的上升都将会招致柱性能的降低;
d.假如流出的溶剂里不含有气泡,阐明柱内的气体曾经被排出了,再将色谱柱以正确的方向接好,这样气泡就进不到色谱柱里面了。
3、色谱柱的清洗
为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中,在每次的样品剖析工作完成之后,都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱才能强的溶剂来洗脱色谱柱,以剖析工作中常用的反相色谱剖析法为例,因其先流出的物质是极性大的物质,此时应用100%的甲醇或运用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来,洗脱液的用量普通为柱体积的20倍即可。假如活动相是缓冲溶液,则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱,以冲掉柱内的盐,然后再用适宜的溶剂来冲洗。
凝胶滤过色谱法(Gel Filtration Chromatography)中所运用的凝胶柱常用缓冲溶液做活动相,用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。假如是连续操作,能够将缓冲溶液置于柱内过夜,但最好是维持小流速(<0.5ml/min)以避免缓冲盐的析出,假如活动相中含有卤化物,即便是停一夜,也必需要用蒸馏水将色谱柱冲洗洁净,以避免它们对柱体的腐蚀。
4、色谱柱的寄存
假如色谱柱暂时不用,寄存时要留意以下几点:
a.几天之内的短期放置,应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗),再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。
b.假如色谱柱长期不用,仅用上述办法来处置就不行了,这时应运用色谱柱运用阐明书中所指明的溶剂来充溢色谱柱,反相柱普通运用甲醇,正相柱则可用正已烷或庚烷,而凝胶柱则不能用水了,因柱内假如有微生物的生长则会使柱效降低,此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱,再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时,一定要将色谱柱的两端封严,以避免由于溶剂挥发而形成的柱填料干缩现象,因这可招致柱效的严重降低。
c.色谱柱应储存在室温下,假如放置于0℃以下的环境里,柱内就会结冰,这也将招致柱效的降低。
五、色谱峰的双峰问题

长期运用后的色谱柱,假如有杂质进入,就会使色谱柱入口处的固定相“板结”并在活动相所产生的高压作用下,构成柱头的塌陷,被剖析的样品组分的正常色谱峰就变成了双峰,这时可按下述办法来修复色谱柱。首先将柱头的紧固螺母旋下,这时就会发现柱头内的固定相已被紧缩进去了,严重时可缩进10mm以上。在这种状况下,我们可用针尖将活动相表层板结变黄的局部抠掉,并以相同的固定相将此塌陷区填平、压实,再将色谱柱的紧固螺丝上紧,修复工作即告完毕。用经过修复后的色谱柱再做样品时,色谱峰就恢复正常了。

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